【摘要】目的：研究牙齦卟啉單胞菌及其可溶性毒力因子對人多形核白細胞的影響，探討其導(dǎo)致慢性牙周炎發(fā)生的作用機制。方法：采集健康中老年人外周血，利用透射電鏡觀察多形核白細胞培養(yǎng)組(對照組)與牙齦卟啉單胞菌超聲粉碎濾液共同培養(yǎng)組(實驗組)多形核白細胞脫顆粒現(xiàn)象。結(jié)果：實驗組多形核白細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，而對照組細胞無明顯變化;實驗組脫顆粒白細胞百分?jǐn)?shù)較對照組顯著增多(P<0.001)。結(jié)論牙齦卟啉單胞菌可誘導(dǎo)多形核白細胞中顆粒向細胞周邊移動并脫出，從而降低宿主的免疫能力,在慢性牙周炎發(fā)生中具有重要作用。

【關(guān)鍵詞】牙齦卟啉單胞菌 多形核白細胞 細胞脫顆粒

慢性牙周炎在中老年人中的患病率極高，是導(dǎo)致中老年人群牙齒缺失的主要原因。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)是慢性牙周炎重要的可疑致病菌之一^①，可通過其可溶性產(chǎn)物對牙周組織造成損傷，而多形核白細胞(polymorphonuclearleukocytes，PMNLs)是機體抵抗病菌入侵的第一道防線^②。在牙周炎發(fā)病過程中，宿主自身抵抗力的差異性是一個重要的因素，PMNLs的功能正常與否，直接關(guān)系著機體免疫力的高低。研究發(fā)現(xiàn)：牙周致病菌與PMNLs的相互作用在牙周病的致病機制中起重要作用^③④。目前針對P.g可溶性毒力因子對PMNLs影響的系統(tǒng)研究較少，本研究旨在通過觀察P.g超聲濾液誘發(fā)PMNLs脫顆粒的形態(tài)變化，探討P.g可溶性毒力因子對PMNLs的影響。

1、材料與方法

1.1 細菌菌種與研究對象

P.g標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33277(購自上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所)。選擇10例健康老年人為試驗對象，男女各5例，平均年齡(60±5)歲，所有受試者均知情同意。受試者的選擇標(biāo)準(zhǔn)包括：無全身性疾病;近3個月無服用抗生素類藥物;無活動性齲，牙周健康。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)及超聲濾液的制備

將P.g接種在血液瓊脂培養(yǎng)基中(營養(yǎng)瓊脂加10%新鮮兔血)，10%CO2的厭氧環(huán)境，37℃培養(yǎng)24h。將生長良好的細菌用生理鹽水洗下，配置成2單位麥?zhǔn)媳葷峁艿臐舛?6×108CFU/ml)，將該濃度的細菌置超聲儀中超聲粉碎(PG115型超聲破碎儀，德國MSE公司)，取上清進行過濾，濾過液置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外周血PMNLs的分離培養(yǎng)

取10例健康老年人靜脈血20ml，肝素抗凝后，用不連續(xù)密度梯度Percoll分離PMNLs。先將70%濃度Percoll溶液緩慢加入試管中，再加50%濃度的Percoll溶液，使之形成滿意的界面。加抗凝血(約1.5ml)后離心25min，收取多形核細胞層，將細胞用不含血清的培養(yǎng)液洗滌2次，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液(5×106/ml)，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h。

1.2.3 細菌超聲濾液作用于PMNLs

隨機分為兩組，實驗組在PMNLs內(nèi)加入P.g超聲粉碎濾液200μl，對照組的PMNLs內(nèi)加入RPMI1640培養(yǎng)液。在0、10、30和60min4個時間段進行電鏡觀察。

1.2.4 透射電鏡樣品的制備

將細胞懸液離心15min，沉積細胞經(jīng)2.5%戊二醛固定，1%鋨酸固定后，乙醇系列脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后用醋酸雙氧及檸檬鉛雙重染色，透射電鏡(JEM1200EX)觀察、攝片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用成組設(shè)計兩樣本均數(shù)比較t檢驗。

2、結(jié)果

2.1 P.g超聲濾液誘發(fā)PMNLs脫顆粒的形態(tài)變化

電鏡觀察顯示：對照組中各時間點PMNLs形態(tài)完整，細胞漿內(nèi)無明顯顆粒，細胞膜邊緣整齊，細胞核呈分葉狀、飽滿(圖1A)。而實驗組中PMNLs在P.g超聲濾液作用10min時，細胞內(nèi)有明顯的顆粒聚集并向細胞周邊移動的現(xiàn)象(圖1B)，在30和60min時，PMNLs出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象，同時伴有細胞不完整，細胞膜不光滑，細胞核皺縮的現(xiàn)象(細胞凋亡出現(xiàn))，甚至出現(xiàn)細胞裂解死亡。

2.2 脫顆粒的PMNLs與正常PMNLs百分?jǐn)?shù)的比較

P.g的超聲濾液加入PMNLs后在0、10、30、60min4個時間點利用電鏡觀察。結(jié)果顯示：在10、30和60min3個時間點變現(xiàn)出差異，實驗組在10min時脫顆粒的PMNLs增多，在之后的時間里得到了持續(xù)，而對照組波動較實驗組穩(wěn)定。兩組脫顆粒的PMNLs數(shù)

3、討論

老年人的牙周附著喪失重于年輕人，慢性牙周炎多見于中老年人。牙齦卟啉單胞菌是目前公認的牙周致病菌之一，也是牙周微生物領(lǐng)域重點研究的厭氧菌之一，與慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫和牙髓感染以及伴發(fā)性全身性系統(tǒng)疾病密切相關(guān)^⑤⑥。病原菌致病是一個多因素共同作用的過程，有參與基本生理過程的看家基因和多種毒力基因參與。P.g基因的多態(tài)性與復(fù)雜性使得其致病機制迄今尚不明了，已發(fā)現(xiàn)的P.g的毒力因子包括菌毛、牙齦素、脂多糖(LPS)等^⑦⑧。

PMNLs是機體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，既是白細胞中功能最活躍的多功能細胞，也是參與炎癥反應(yīng)的主要細胞。PMNLs具有吞噬作用，能夠在感染組織中遷移,預(yù)防炎癥的擴散，是細胞免疫和體液免疫的積極參與者，主要通過釋放多種蛋白水解酶而發(fā)揮殺菌功能^⑨。當(dāng)PMNLs不能正常行使其功能時，細菌不僅不會被殺死，而且可以抑制溶酶體和吞噬體的融合。即便是PMNLs的吞噬能力正常，但對趨化性反應(yīng)遲鈍，不能游走至趨化因子刺激的部位，會使感染經(jīng)久不愈。PMNLs的殺菌作用主要依賴于吞噬溶酶體中顆粒成分所調(diào)節(jié)的非氧化機制。顆粒成分的細胞外釋放可能抵消PMNLs內(nèi)殺傷作用，降低局部的免疫防御功能和屏障作用。導(dǎo)致溶酶體成分細胞外分泌的主動過程為細胞支架的聚合，它是顆粒向細胞周邊的轉(zhuǎn)運機制^⑨。此外，脫顆粒將導(dǎo)致牙周組織內(nèi)溶酶體混合成分濃度的增加，它不僅有害于宿主細胞，而且還可以參與牙周組織的病理過程加劇炎癥反應(yīng)^⑩。

將P.g用超聲波粉碎機粉碎，濾液內(nèi)會含有該菌的絕大部分可溶性毒力因子。研究這種濾液既可以避免菌體本身的不確定性又能避免單一成分的不完整性，是一種方便、可靠的有效途徑^④。本實驗將P.g超聲粉碎濾液與健康中老年人外周血中的PMNLs共同培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實驗組(在PMNLs中加入P.g超聲粉碎濾液)和對照組(在含抗毒血清的PMNLs中加入P.g超聲粉碎濾液)存在顯著差異，實驗組脫粒的PMNLs百分?jǐn)?shù)明顯高于對照組，同時隨時間的延長，脫顆粒現(xiàn)象更加明顯。

本研究認為，P.g的超聲粉碎濾液能夠使健康中老年人外周血中的PMNLs發(fā)生脫顆粒，從而通過降低宿主的免疫功能導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生、發(fā)展。值得注意的是，口腔是一個多種微生物定植的微生態(tài)系統(tǒng)，各種微生物之間相互依存、相互制約，不能單純的用單一致病菌對組織的損害來說明口腔微生物群的作用。此外，不同個體的PMNLs的自身存在功能的差異，是否會對研究結(jié)果產(chǎn)生差異，還需在今后的工作中進一步研究。

【參考文獻】

[1]Ezzo PJ，Cutler CW.Microorganisms as risk indicators for periodontal disease.Periodontol,2000;2003，32(1):23 4.

[2]Van Dyke TE，Vaikuntam J.Neutrophil function and dys function in periodontal disease.Curr Opin Periodontol,1994;2:19 27.

[3]王惠寧,潘乙懷,金尚青,等.牙齦卟啉菌表面相關(guān)物質(zhì)對多形核白細胞的影響.口腔醫(yī)學(xué)研究，2004;20(6):583 5.

[4]李,王萬成.伴放線放線桿菌超聲粉碎液誘導(dǎo)外周血中多形核白細胞脫粒的體外研究.口腔醫(yī)學(xué)研究，2006;22(5):504 6.

[5]周婷,徐屹,丁一等.慢性牙周炎齦下菌斑中五種牙周可疑致病微生物的分布.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007;25(5)：470 3.

[6]方廠云,蘇征,陳蕾等.牙齦卟啉單胞菌脂多糖對人牙周膜成纖維細胞膠原吞噬作用的影響.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007;25(4)：339 41.

[7]Zhao L，Wu YF，Meng S,et al.Prevalence of fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis and periodontal health status in Chinese adults.J Periodontal Res，2007;42(6)：511 7.

[8]楊明華，李 升，肖建平，等.中藥的大黃治療重度牙周炎的臨床觀察.口腔醫(yī)學(xué)研究，2008;24(3)：305 7.

[9]Lowell CA，Berton G.Integrin signal transduction in myeloid leukocytes.J Leukoc Biol，1999;65(3):313 20.

[10]Lamster IB.The host response in gingival crevicular fluid：potential application in periodontitis clinical trials.J Periodontol,1992;63(12):1117 23.