【摘要】目的:探討基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)對(duì)腦血管壁細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)破壞在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。方法:對(duì)15例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)本和6例非腦血管病病人的正常腦血管，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腦血管壁組織內(nèi)MMP-9mRNA的基因表達(dá)水平，并通過電鏡觀察顱內(nèi)動(dòng)脈瘤病人血管壁細(xì)胞及ECM的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:動(dòng)脈瘤壁組織中MMP-9mRNA的表達(dá)是正常腦血管的10.06倍(P<0.01)。電鏡下見動(dòng)脈瘤壁內(nèi)皮細(xì)胞損傷，中層平滑肌細(xì)胞數(shù)目明顯減少并呈凋亡狀態(tài)，ECM嚴(yán)重破壞;而正常腦血管壁細(xì)胞及基質(zhì)纖維清晰可見，結(jié)構(gòu)完整。結(jié)論:顱內(nèi)動(dòng)脈瘤壁組織中MMP-9的基因表達(dá)水平顯著升高，并可能通過破壞ECM和誘導(dǎo)平滑肌凋亡參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】顱內(nèi)動(dòng)脈瘤 明膠酶B 細(xì)胞外基質(zhì) 顯微鏡檢查 電子 透射

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)：動(dòng)脈瘤壁組織中過度表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)通過破壞腦血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病。有關(guān)誘發(fā)MMP-9過度表達(dá)通路的研究較多[1-3]，但對(duì)其破壞ECM超微結(jié)構(gòu)研究的報(bào)道甚少。為此，我們對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)本應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)瘤壁組織內(nèi)MMP-9mRNA的基因表達(dá)水平，通過透射電鏡觀察血管壁細(xì)胞及ECM超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化，并與正常腦血管進(jìn)行比較，報(bào)道如下。

1、材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 15例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)本來(lái)自四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科近年來(lái)經(jīng)開顱手術(shù)，在順利夾閉動(dòng)脈瘤并保證病人安全的前提下獲取;男3例，女12例;平均年齡55歲(動(dòng)脈瘤組)。同時(shí)取6例非動(dòng)脈瘤病人的腦血管作為對(duì)照組，所有標(biāo)本均經(jīng)華西醫(yī)院病理科明確診斷。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)

1.2.1 主要試劑：總RNA提取試劑(TrizoltotalRNAIsolationReagent，GibcoBRL，USA)、RT-PCR試劑盒(MBI公司，Lithuania)、PCR試劑盒(MBI公司，Lithuania)、Taq酶(MBI公司，Lithuania)、dNTP(MBI公司，Lithuania)、引物根據(jù)NCBIGeneBank中的人MMP-9cDNA序列(NM：004994，gi：4826835)，按照5'端相同、3'端互補(bǔ)的原則，兼顧Tm值、G+C含量等因素進(jìn)行設(shè)計(jì)合成、純化，用無(wú)RNase的滅菌雙蒸水溶解為10mmol/L。探針由上海生工生物工程公司合成和檢測(cè)。根據(jù)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA原始序列設(shè)計(jì)合成GAPDH(NM：002046，gi：7669491)特異的引物與探針，上游引物：5'-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3;下游引物：5'-CCAAAGTTGTCATGGATGACCT-3'。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系和條件：MIX94℃2min變性后，進(jìn)行熱循環(huán);94℃20s、53℃30s、60℃40s收集熒光，循環(huán)次數(shù)：45次。

1.2.3 總RNA提取和mRNA分離：Trizol法提取標(biāo)本細(xì)胞，總RNA紫外分光光度計(jì)分析其純度，并電泳驗(yàn)證MMP-9條帶。

1.2.4 制作MMP-9基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線：按程序進(jìn)行相應(yīng)模板的PCR反應(yīng)和獲取熒光定量PCR，結(jié)果制作成MMP-9基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各待測(cè)樣本靶基因的相對(duì)Ct值減去內(nèi)對(duì)照GAPDH的Ct值，獲得校正后的相對(duì)ΔCt值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩組樣本均數(shù)行t檢驗(yàn)。同時(shí)比較動(dòng)脈瘤組織中MMP-9與正常對(duì)照組表達(dá)水平的倍比關(guān)系。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 新鮮標(biāo)本經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，Epon812包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片6μm，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，行H-600IV型透射電鏡觀察。

2、結(jié)果

2.1 MMP-9mRNA在不同腦血管內(nèi)的表達(dá)水平

2.2 電鏡結(jié)果 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組：內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可見細(xì)胞固縮或空泡變性，中層平滑肌細(xì)胞數(shù)目明顯減少，多數(shù)細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊聚，可見凋亡小體，部分線粒體腫脹，正常內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失，構(gòu)成細(xì)胞骨架的ECM模糊不清，呈無(wú)定形的絮狀物質(zhì)，細(xì)胞缺失的部位有較多碎片(圖1);而正常對(duì)照組腦血管壁基質(zhì)纖維清晰可見，結(jié)構(gòu)完整。

3、討論

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，通常認(rèn)為是遺傳學(xué)、異常血流動(dòng)力學(xué)以及血管壁后天退行性變等多種因素綜合作用的結(jié)果。國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)：基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，尤其是MMP-9與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成關(guān)系極為密切。劉兵等[4]運(yùn)用免疫組化SP法和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-9表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子IL-1α和血小板源性生長(zhǎng)因子-B(PDGF-B)能夠誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)，降解膠原蛋白;結(jié)合顱內(nèi)動(dòng)脈瘤病人血管壁上有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及其分泌的大量細(xì)胞因子，因此認(rèn)為：過量表達(dá)的MMP-9參與了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展乃至破裂。1997年，Kim等[1]研究顱內(nèi)動(dòng)脈瘤夾閉后手術(shù)切除標(biāo)本發(fā)現(xiàn)：動(dòng)脈瘤壁上MMP-9表達(dá)明顯升高，而血漿和對(duì)照組顳淺動(dòng)脈壁未見升高。Gaetani等[5]研究發(fā)現(xiàn)：動(dòng)脈瘤壁局部(而非全部)的MMP活性變化參與了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成和破裂。韓利江等[6]應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)5例腦動(dòng)脈瘤病人MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MMP-9mRNA在所有顱內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)本中均有表達(dá)，陽(yáng)性雜交信號(hào)密集存在于內(nèi)膜，尤其是內(nèi)彈力層。Sehba等[7]通過研究大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)分叉部穿孔誘導(dǎo)的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：微血管內(nèi)MMP-9表達(dá)水平在局部升高的同時(shí)伴隨Ⅳ型膠原減少或消失。本研究結(jié)果也顯示：顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中MMP-9mRNA表達(dá)水平顯著性高于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明過度表達(dá)的MMP-9可能參與了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族可由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞以非酶原形式合成分泌，其主要功能是降解構(gòu)成ECM的膠原蛋白、彈性蛋白和非膠原糖蛋白，其中以MMP-9對(duì)ECM的破壞性最強(qiáng)[8]。本研究通過透射電鏡觀察到，動(dòng)脈瘤血管壁內(nèi)皮細(xì)胞呈固縮或空泡變性，內(nèi)彈力板疏松分層或完全消失，血管壁平滑肌細(xì)胞大量凋亡，中膜主要由數(shù)量不等的纖維細(xì)胞構(gòu)成，纖維細(xì)胞之間為大片膠原及無(wú)定形的絮狀物質(zhì)，說(shuō)明過度表達(dá)的MMP-9對(duì)ECM的破壞使血管壁變薄膨出，可能是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成及破裂的重要機(jī)制之一。

【參考文獻(xiàn)】

[1] KIM S C,SINGH M, HUANG J,et al.Matrix metalloproteinase-9 in cerebral aneurysms [J]. Neurosurgery,1997, 41(3): 642-647.

[2] CROWE D L, TSANG K J, SHEMIRANI B. Jun N-terminal kinase 1 mediates transcriptional induction of matrix metalloproteinase 9 expression [J]. Neoplasia, 2001, 3(1):27-32.

[3] TAKAGI Y, ISHIKAWA M, NOZAKI K, et al. Increased expression of phosphorylated c-Jun amino-terminal kinase and phosphorylated c-Jun in human cerebral aneurysms: role of the c-Jun amino-terminal kinase/c-Jun pathway in apoptosis of vascular walls [J]. Neurosurgery, 2002, 51(4): 997-1004.

[4] 劉兵, 浦佩玉, 高永中. PDGF-B與IL-1α對(duì)大鼠動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MMP表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué),2003,11(4): 363-366.

[5] GAETANI P, RODRIGUEZY BAENA R,TARTARA F, et al.Metalloproteases and intracranial vascular lesions [J]. Neurol Res, 1999, 21(4): 385-390.

[6] 韓利江, 趙繼宗,王碩,等.人腦動(dòng)脈瘤及其皮層小動(dòng)脈組織72-和92-KdaⅣ型膠原酶mRNA的原位雜交研究 [J]. 中華神經(jīng)外科雜志, 1999, 15(3): 156-159.

[7] SEHBA F A, MOSTAFA G, KNOPMAN J, et al. Acute alterations in microvascular basal lamina after subarachnoid hemorrhage [J]. J Neurosurg, 2004, 101(4): 633-640.

[8] GALT S W, LINDEMANN S, MEDD D, et al. Differential regulation of matrix metalloproteinase-9 by monocytes adherent to collgen and platelets [J].Circ Res,2001,89(6): 509-516.